Nuestra capacidad para revelar los detalles más ínfimos de la biología celular ha aumentado considerablemente gracias al descubrimiento y avance de diversas técnicas de visualización. Entre ellas destaca el uso de las proteínas fluorescentes. En esta revisión describimos algunas propiedades generales de las proteínas fluorescentes que son esenciales para sus funciones. También proporcionamos una visión general de las aplicaciones de estas proteínas para aumentar el conocimiento sobre el metabolismo y la biología celular.
Introducción
Micrografía de fluorescencia mostrando células de mamífero expresando la proteína verde fluorescente en su citoplasma.
La proteína verde fluorescente original (GFP; del inglés Green Fluorescent Protein) fue descubierta en los años 60 por investigadores que estudiaban las propiedades bioluminiscentes de la medusa Aequorea victoria. Sus estudios dieron como resultado el aislamiento de una proteína bioluminiscente llamada aequorina, junto con otra proteína, que pasó a llamarse GFP. Estas dos proteínas trabajan juntas en los órganos de la medusa para convertir las señales luminiscentes inducidas por Ca2+ en la luminiscencia verde característica de esta especie. La GFP es una proteína monomérica de unos 230 aminoácidos que forma una estructura terciaria conocida como barril beta, común en muchas otras proteínas florescentes caracterizadas posteriormente. En esta proteína, el barril beta está formado por 11 cadenas. Pero lo realmente interesante de esta estructura es que además incluye una hélice alfa central que atraviesa el barril en toda su longitud. En esta hélice está el secreto de la fluorescencia de la GFP. Hay tres aminoácidos consecutivos en ella que forman un cromóforo natural, de forma que cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta, produce una brillante fluorescencia verde.
La GFP es en realidad una señal luminosa codificada genéticamente, que puede expresarse en células mediante las técnicas rutinarias de transgénesis. Al llevar la fluorescencia incorporada en su estructura, esta señal es creada dentro de la célula, eliminando la necesidad de marcar con agentes exógenos y también los procedimientos de fijación y permeabilización de la inmunofluorescencia clásica. En otras palabras, la fluorescencia de la GFP se produce y mantiene espontáneamente en células vivas que incluyan el gen que la codifica. Además, su código genético puede fusionarse a otras proteínas, proporcionando a éstas un “dominio extra” fluorescente que permite seguirlas in vivo. Como en estas fusiones la GFP se expresa en una proporción 1 a 1, la cuantificación de la señal sirve para establecer de forma precisa la cantidad de la proteína fusionada.
Estado actual
La GFP fue utilizada por primera vez para seguir el trayecto de la expresión de genes en bacterias y en las neuronas sensoriales del nematodo C. elegans. La caracterización y demostración de esta utilidad de la GFP impulsó la búsqueda de otras proteínas parecidas en otros seres vivos. Además, dada la particular estructura del característico barril beta, pronto fue explotado el potencial de modificación en la secuencia de aminoácidos de esta naciente colección, para producir cambios en sus propiedades fluorescentes. El resultado más relevante en relación con estos estudios es el impresionante rango de colores de emisión disponible actualmente, que incrementa la utilidad de estas proteínas como sondas moleculares.
Para poder utilizar las diversas variantes de GFP en mamíferos, hubo que modificar algunas de las propiedades de la proteína original, variaciones que ahora se encuentran en todas las versiones más comúnmente utilizadas. En primer lugar, la maduración de la fluorescencia fue optimizada para su uso a 37 ºC. También se incluyeron modificaciones para hacer el plegamiento de estas proteínas más rápido, para mejorar su fotoestabilidad y para reducir su sensibilidad al calor. Finalmente, el código genético de estas proteínas fue adaptado para optimizar su expresión en mamíferos.
Las proteínas fluorescentes son excelentes para un enorme número de aplicaciones y particularmente para visualización de células vivas y en animales de experimentación. Han sido artífices directas del avance de nuestro conocimiento acerca de la biología y funciones celulares. El número de oportunidades experimentales para utilizarlas tiene su base en la diversidad de fluoróforos, uqe permite marcar con diferentes colores proteínas, compartimentos celulares o células complejas. De hecho, en la actualidad, al menos cinco proteínas fluorescentes de diferentes colores pueden ser visualizadas en paralelo. En uno de esos ensayos, pudieron marcarse y observarse de forma combinada el núcleo, los peroxisomas, el retículo endoplásmico, las adhesiones focales y las mitocondrias.
A medida que se caracterizaban y generaban nuevas variantes de proteínas fluorescentes con características especiales, han surgido nuevas aplicaciones. Por ejemplo, las variedades fotoactivables han permitido la medición precisa de eventos de difusión y tráfico molecular, además de dar lugar a métodos experimentales de muy alta resolución, incluyendo la visualización mediante microscopía de moléculas individuales.
Las proteínas fluorescentes han permitido el desarrollo de biosensores diseñados para detectar iones intracelulares y segundos mensajeros, medir potenciales de membrana, activación de receptores, interacciones entre proteínas y otras muchas funciones metabólicas. También han sido adaptadas para su uso en fotoquímica localizada no relacionada con la fluorescencia. Un ejemplo de esto es la proteína KillerRed, que genera especies reactivas del oxígeno al ser excitada, por lo que puede ser utilizada para localizar la producción de estas especies del oxígeno y para destruir células específicas.
Actualmente, el foco de atención se centra en el descubrimiento y creación de proteínas fluorescentes mejoradas para el espectro del rojo y el rojo lejano. Estas variantes son especialmente importantes para su uso en células de mamífero, ya que la autofluorescencia y la absorción de luz por los tejidos es mucho menor en esa zona que en las porciones azul y verde del espectro visible. Esto hace que estas proteínas sean idóneas para su uso en muestras gruesas y en animales completos.
Conclusiones
Un esquema animado del flujo de información en la célula desde el ADN al ARN y a la proteína.
En la actualidad disponemos de un amplísimo rango de proteínas fluorescentes y sus variantes, que abarcan casi todo el espectro de luz visible. Estas proteínas son ahora herramientas indispensables en la investigación básica y su utilización está en la base de la caracterización de genes y proteínas, en el estudio y explicación de diversas funciones y procesos celulares e incluso en la investigación de patologías como el cáncer. Estos usos tan extendidos tienen como protagonistas a las proteínas fluorescentes clásicas. Sin embargo, están emergiendo variedades que permiten utilidades radicalmente diferentes y que expanden la utilidad de estas proteínas. Por ejemplo, se están desarrollando formas que requieren para su fluorescencia de cofactores externos y que permiten aumentar el rango del espectro disponible hacia el infrarrojo. Otra clase de marcadores de reciente caracterización utiliza secuencias específicas de reconocimiento para reclutar fluoróforos orgánicos como la fluoresceína, abriendo las puertas a sistemas fluorescentes híbridos.
El potencial de las proteínas fluorescentes como biosensores comienza a apreciarse ahora. El número de biosensores basados en estas proteínas está creciendo rápidamente y ya ha sido posible desarrollar sondas con sensibilidad mejorada. El éxito de estos esfuerzos sugiere que en el futuro, casi cualquier parámetro biológico podrá ser medible con un biosensor basado en proteínas fluorescentes.
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